Dados do Trabalho

Título

UTILIZAÇAO DE CRISPR/CAS9 COMO UMA FERRAMENTA PARA AVALIAÇAO FUNCIONAL DE VARIANTES GENETICAS DO LDLR EM PORTADORES DE HIPERCOLESTEROLEMIA FAMILIAL

Introdução

A Hipercolesterolemia Familial (HF) é uma das principais causas de doenças cardiovasculares, sendo causado principalmente por variantes genéticas no gene do Receptor de Lipoproteínas de Baixa Densidade (LDLR). Apesar das tecnologias de sequenciamento de próxima geração (NGS) serem capazes de identificar diversas variantes, poucas delas foram funcionalmente caracterizadas. A utilização da ferramenta de edição gênica CRISP/Cas9 promove uma edição gênica precisa e permite a criação de modelos experimentais, de forma a contribuir para a melhor validação funcional dessas variantes. O objetivo deste trabalho é realizar a avaliação funcional de variantes do LDLR identificadas em portadores de HF, através da utilização de CRISPR/Cas9.

Material e Método

Baseado em análises de predição in sílico, do domínio afetado da proteína e na frequência da variante na população, selecionou-se duas variantes do LDLR (c.551G>A p.Cys184Tyr e c.118G>A p.Gly373Asp), e construiu-se três sgRNAs para cada um deles. Os sgRNAs foram inseridos no plasmídeo PX458, clonados e purificados em bactérias E. coli DH5α, e então co-transfectados com o modelo de reparo de DNA em células HepG2. A eficiência de co-transfecção foi avaliada por citometria de fluxo. As células HepG2 foram inicialmente sequenciadas por Sanger para garantir que não havia nenhuma variante que pudesse interferir na avaliação. As variantes foram também analisadas por docking molecular para avaliar o efeito das variantes.

Resultados

Células HepG2 co-transfectadas com a variante c.118G>A p.Gly373Asp demonstraram aproximadamente 5% de eficiência de co-transfecção. A análise in silico por docking molecular revelou que a troca de uma Glicina por um Ácido Aspártico na posição 373 pode afetar o posicionamento do receptor na membrana, a dissociação com a ApoB e a reciclagem do receptor. Para a variante c.551G>A p.Cys184Tyr, houve uma eficiência de transfecçção de 1,3%, e os resultados de docking molecular revelaram que a substituição de uma CIsteína por uma Tirosina na posição 184 aumenta a afinidade do receptor com a partícula de LDL, afetando portanto o processo de reciclagem.

Discussão e Conclusões

Até o momento, foram sintetizados sgRNAs para as duas variantes descritas, sendo possível analisar as diferentes taxas de co-transfecção avaliadas por citometria de fluxo. Os resultados de docking molecular apresentaram resultados interessantes e que incentivam o maior aprofundamento na metodologia descrita para análise de demais variantes genéticas.

Palavras Chave

Hipercolesterolemia Familial; CRISPR/Cas9; Análise funcional; LDLR

Área

Pesquisa Básica